y División Española de la International Academy of Pathology
XX Congreso de la Sociedad Española de Citología
I Congreso de la Sociedad Española de Patología Forense
INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES ORALES Y PÓSTERES ACEPTADOS
Póster nº 5. Tema: Técnicos de Anatomía Patológica (TEAP)
Protocolización del pretratamiento de las muestras incluidas en parafina para la extracción automática de ADN en la detección de VPH mediante test de genotipado linear array
AB Sánchez García, A B Sánchez García, A Téllez Torres, C Sánchez Estévez, H Ramos Vaca, R M García Velasco, T Fernández Muñoz, A Moreno Torres, J C Tardío
H.U. Fuenlabrada
anitabelsan@hotmail.comIntroducción:El virus del papiloma humano (VPH) es un virus ADN que tiene un papel patogénico demostrado en diversas enfermedades cutáneas y mucosas, incluyendo carcinomas y lesiones precancerosas de distintas localizaciones. Hasta la fecha se han identificado más de 100 genotipos de VPH. La detección y tipificación del VPH es de gran importancia en el estudio y diagnóstico de diversos procesos patológicos. Para las citologías en base líquida existen protocolos automatizados estándar de genotipado de VPH, no así para tejidos incluidos en parafina. En nuestro Servicio hemos desarrollado un protocolo propio de pretratamiento de las muestras incluidas en parafina, para la extracción automátizada de ADN en la determinación de VPH mediante test de genotipado“linear array”.
Material y métodos:Se han estudiado 143 biopsias fijadas en formol e incluidas en parafina mediante el método Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Molecular Diagnostics). Se realizaron hasta 5 cortes de 10-15 µm de cada muestra, fueron pretratados con 200 µl de tampón Tris 50 mM a pH 8 y se incubaron 10´a 95ºC, fueron digeridos con 10µl de proteínasa K a 56ºC durante toda la noche. Las muestras se centrifugaron a 12000rpm durante 15´, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 200 µl de la mezcla a 200 µl de ATL y 650 µl de solución PreservCyt (Thin-Prep,Cytic). A continuación,las biopsias se manejaron siguiendo el protocolo de la casa comercial tanto para la extracción de ADN con COBAS AmpliPrep (Roche Molecular Diagnostics), como para la posterior amplificación y detección con el kit de Linear Array HPV Genotyping Test.
Resultados:Con esta metodología conseguimos amplificación de ADN en el 93,7% de los casos. En un 46,9% se detectó VPH (7% genotipos de alto riesgo,35,7% de bajo riesgo y 4,2% de alto y bajo riesgo), el 46,8% fueron negativos para VPH y en un 6,3% el ADN no amplificó. El mayor porcentaje de casos insatisfactorios corresponden al primer año de puesta en marcha de este protocolo. En la mayor parte de los casos que no amplificaron se consiguió un resultado posterior valorable diluyendo el ADN. En el último año han amplicado el 100% de los casos estudiados.
Conclusión:Nuestro protocolo de pretratamiento de muestras parafinadas, permite el manejo posterior del tejido de modo semejante a las muestras citológicas en medio líquido, con estandarización del procedimiento, desde la extracción automatizada hasta la detección. Las inhibiciones de la amplificación se deben generalmente a exceso de ADN. En los casos con resultado insatisfactorio se debe proceder a la dilución del mismo.
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| © SEAP. Sociedad Española de Anatomía Patológica | Actualizado: 11/06/2011 |